一、何謂原代培養(yǎng)？

原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取組織或器官的一部分進行培養(yǎng)，即組織直接從機體獲取后，通過組織塊長出單層細胞，或者用酶消化或機械方法將組織分散成單個細胞開始培養(yǎng)，在首次傳代前的培養(yǎng)可認為是原代培養(yǎng)。

原代培養(yǎng)的過程指動物的組織或器官從機體取出后，經(jīng)機械法或各種酶類（常用胰蛋白酶）和螯合劑（常用EDTA）處理，使之分散成單個細胞，加入適量培養(yǎng)基，置于合適的培養(yǎng)容器中，在無菌、適當溫度和一定條件下，使之生存、生長和繁殖的過程。

二、原代培養(yǎng)的方法

?組織塊培養(yǎng)法：在無菌條件下，從有機體取下組織，用平衡鹽緩沖液漂洗數(shù)次后剪碎，加培養(yǎng)液進行培養(yǎng)的方法。是常用的、簡便易行和成功率較高的方法。

?酶消化法：將組織剪成小塊，然后用蛋白酶消化成單細胞懸液后，再接種培養(yǎng)的方法。

?懸浮細胞培養(yǎng)法：對于懸浮生長的細胞，如白血病細胞、淋巴細胞、骨髓細胞、胸水和腹水中的癌細胞和免疫細胞無需消化，可采用低速離心分離，直接培養(yǎng)，或經(jīng)淋巴細胞分層液分離后接種培養(yǎng)。   
?器官培養(yǎng)：從供體取得器官或組織塊后，不進行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng)，其特性仍保持原有器官細胞的組織結構和聯(lián)系、并能存活，器官培養(yǎng)的目的和技術均與單層細胞培養(yǎng)不同，但可利用器官培養(yǎng)對器官組織的生長變化進行體外觀察。并觀察不同培養(yǎng)條件研究對器官組織的影響。器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對完整性，可用于重點觀察細胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響，以及局部環(huán)境的生物調節(jié)作用。體外器官培養(yǎng)為臨床上的器官移植創(chuàng)造了便利的條件。器官培養(yǎng)的條件與細胞培養(yǎng)不同，要有特殊的要求。 

三、前期準備及器材處理

1.前期準備

在您帶上手套開始細胞培養(yǎng)之前,先檢查一下移液管和瓶子的數(shù)量是否充足,以免在開始實驗后再次出入操作臺.

這樣可以降低細胞污染的風險.

細胞培養(yǎng)基也應先預熱,選擇只預熱部分培養(yǎng)基而非整瓶加熱,不但可以節(jié)約實驗時間,而且可以避免因反復加熱培養(yǎng)基而造成的蛋白質降解.

結束操作后,別忘了培養(yǎng)基對光敏感,應盡可能避光保存.

2.生物安全柜的消毒及布局

保持安全柜內的整潔有序，將所有物品置于直視范圍內。

向放入安全柜內的所有物品噴灑70%乙醇，擦拭清潔進行消毒。

在安全柜中部開闊處放置細胞培養(yǎng)容器；移液器置于右前方易于取用；試劑和培養(yǎng)基置于右后方便于吸取；試管架置于中后部；小型容器置于左后部用于盛放廢液。

3.培養(yǎng)瓶/皿等物品的無菌操作

無菌培養(yǎng)瓶、試劑瓶、培養(yǎng)皿等物品使用時方可揭開蓋子，不得將其開放暴露于環(huán)境中，操作完成后盡快蓋上蓋子，取下蓋子時應將蓋子開口朝下放在工作臺面上。

進行無菌操作時不要說話、唱歌或吹口哨。盡快完成實驗，以盡量避免污染。

四、原代細胞培養(yǎng)流程（例：乳鼠肺組織）

1.取材：將1-3天新生乳鼠尾巴提起，整個身體浸入裝有75%酒精的燒杯中3秒左右（默數(shù)5下），取出放置到滅菌的培養(yǎng)皿中，移入工作臺內。小鼠仰位固定在泡沫塑料板上，大頭針分別固定頭、尾和四肢。用碘酒、75%酒精消毒胸廓部位皮膚。在胸廓正中線中位處，用兩把眼科彎鑷夾起皮膚（多夾些），向左右兩側撕拉，膈肌部位皮膚向尾端拉，皮膚外翻固定，軀干部肌肉暴露（注意：不要使表皮面接觸到已暴露出來的胸腹肌）。酒精消毒乳鼠胸廓后，沿著隔膜剪斷胸廓，并將胸骨兩側肋骨剪斷。胸廓暴露后，可見跳動的心臟和粉紅色的肺。將眼科鑷彎頭端向下，從心臟右上方位插入心肺連接處，輕輕向上用力，將心肺一起取出，用鑷子去除心臟，肺移入已加Hanks也的青霉素瓶內。

2.漂洗：用Hanks液漂洗肺臟表面血污，然后粗剪幾下，再用Hanks液漂洗多次后，吸去多余液體。

3.剪切：組織小塊置青霉素瓶一角，用眼科直剪反復剪切組織塊成1立方毫米大小，此過程需20~30分鐘。

4.消化：消化條件的選擇和組織塊大小、組織的硬度、消化酶濃度和種類、實驗溫度、pH值等有關。消化酶濃度范圍為0.25%~0.5%，pH為7.4~8.0，所使用消化液量是被消化物的5~10倍。可通過預實驗，確定最佳消化條件。

5.制備單細胞懸液

?離心管的外壁和管口處經(jīng)酒精消毒，然后移入超凈臺內，管口火焰消毒，Hanks液加至10ml(稀釋酶濃度，停止消化）

?用吸管頭反復輕輕吹打松散組織，當其能順利地通過吸管口時，消化較合適，懸液中有較多分散的單細胞和小細胞團。

?離心管直立靜置片刻，少量未消化的組織塊自然沉降（可加消化液再消化）。將細胞混懸液移至離心管中，補加Hanks液至10ml，混勻后離心（速度、時間同上）。

科研中常用篩網(wǎng)法去除細胞混懸液中的細胞團，收集過篩網(wǎng)的單細胞懸液。

?去上清液后加2ml細胞培養(yǎng)液，細胞混勻計數(shù)，調整細胞濃度為5.0×105/ml。

6.接種：在培養(yǎng)瓶的側面做好標記，培養(yǎng)物的名稱、組號和日期。接種時，在25ml培養(yǎng)瓶中先加入1.5ml培養(yǎng)液，再接種1ml細胞懸液，用吸管輕輕混勻細胞后加蓋瓶塞。持瓶作上下、左右十字形水平晃動后，移入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

五、原代細胞操作要領

1.原代細胞混勻操作要領

?火焰消毒吸管，用Hanks液冷卻和濕潤管內壁（這是因為剛分離的組織細胞易粘在管壁上）。

?吸管頭插入管底。

?用吸管反復輕輕吹打組織塊。

2.器械的使用操作要領

?用工作臺消毒鑷子取浸泡在酒精中消毒的器械

?器械置無菌干紗布內擦一下，迅速通過火焰，冷卻后使用

?用過的器械置另一加蓋的器皿中再消毒

?器械按浸泡消毒的順序使用

?各套再消毒器械不可混用

3.除去組織塊多余水分的操作要領

用吸管將組織塊推向青霉素瓶一角，然后將有組織塊的瓶面翻向上方，吸去流向對側的多余水分。

注意：多余水分若不除去，會使組織塊剪切不細，消化后的細胞懸液清亮（細胞數(shù)少），并可見消化液中有線狀或絮狀物漂浮。

4.細胞計數(shù)操作要領

?用吸管混勻待計數(shù)的細胞懸液

?將一小滴細胞懸液從蓋玻片與載玻片交接部位滴入細胞計數(shù)池中

?沉降1分鐘，低倍鏡下計數(shù)血球計數(shù)板四大中格中的結構完整的細胞，小細胞團計數(shù)為1

?計數(shù)時，如果細胞壓在格上，則數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右。然后按下式計算出每毫升懸液中的細胞數(shù)。

（四大中格細胞數(shù)/4）×10000=細胞數(shù)/毫升

注：細胞計數(shù)板上，每一中格體積為0.1立方毫米

六、原代培養(yǎng)注意事項

?細胞生長密度不高時，不能急于傳代培養(yǎng)

?原代培養(yǎng)的貼壁細胞需控制消化時間

?吹打已消化的細胞要輕巧，既不能聽到有明顯的吹打聲，又不能有大量泡沫在懸液中形

成，以盡可能減少對細胞的機械損傷

?首次傳代細胞接種數(shù)量應多一點，以利于細胞的生存和繁殖。如果消化分離的細胞懸

液有組織塊，也一并傳入到培養(yǎng)瓶，盡量減少細胞損失。

?首次傳代細胞培養(yǎng)pH偏低些

?胎牛血清濃度可加大至15%-20%

?加入的培養(yǎng)液不宜過多，避免浸泡的組織塊受輕微的波動而脫落下來

七、如何提高原代細胞培養(yǎng)的成功率？

?在選擇材料的時候一定要注意選取比較健康的小鼠。在處理胚胎的時候要干凈利落。不要把胳膊等部位的細胞混進去了。

?操作一定要無菌，不能污染。在剪碎細胞的時候，一定要注意盡量剪得碎一點。

?運用消化法時胰酶溫度應小于37℃，濃度只需平時消化細胞濃度的一半。

?如使用組織塊法，則應待組織塊略干燥，能粘附于瓶壁時再使之與培養(yǎng)液接觸。翻轉培養(yǎng)瓶時要輕，勿使組織塊漂浮起來。

?取材和原代細胞制作時，要用鋒利的器械，如手術刀或剃須刀片切碎組織，盡可能減少對細胞的機械損傷。

八、原代細胞培養(yǎng)的胎牛血清推薦

根據(jù)我們銷售團隊的經(jīng)驗及全國高校老師的反饋結果，Noverse進口血源優(yōu)級胎牛血清或Noverse澳洲優(yōu)級胎牛血清均適合不同細胞的原代培養(yǎng)。不過還可能考慮到您的實驗室環(huán)境、操作人員的操作水平等等，最終來確定您要選擇哪種等級的胎牛血清。